2024-05-30 08:21

为什么要用光散射来分析蛋白质和病毒载体?

热点;nsored有限公司内容由沃特斯|怀亚特科技的见解从industryDr。Michelle chen, wyatt Technology分析科学高级总监

在这次采访中,怀亚特科技公司分析科学部高级主管Michelle Chen博士向NewsMedical介绍了如何使用光散射技术分析蛋白质的多属性定量(MAQ)。

用于大分子和纳米颗粒表征的不同光散射技术有哪些?

有三种光散射技术用于大分子和纳米颗粒的表征:静态、动态和电泳。

静态光散射测量跨越多个散射角的时间平均强度。这种方法通常被称为多角度光散射(MALS),它提供了溶液中蛋白质和其他生物分子的绝对分子量测量,与形状无关。分子量由总散射强度和分子浓度确定,通常用紫外或差示折射法(dRI)测量。

MALS还可以测量纳米颗粒的大小和浓度。在这里,散射光的角度依赖性产生了以均方根半径Rg为单位的粒子大小。对于球形颗粒,这可以转换为球体的半径,半径和总散射强度的知识得到颗粒浓度(颗粒/mL)。

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MALS用于描述生物疗法,如蛋白质、腺相关病毒(aav)和脂质纳米颗粒(LNPs)。DAWN MALS仪器通常与分析尺寸排除色谱,离子交换色谱或场流分馏相结合,用于检测前的初始分离,提供详细的分析。另一方面,ultraDAWN MALS仪器是DAWN的过程分析技术(PAT)版本,用于开发、监测和控制不同尺度的下游生物过程。

动态光散射(DLS)测量由被照射分子或粒子的布朗运动引起的散射光的强度波动。通过分析波动的时间依赖性,可以得到平动扩散系数,该系数用于计算流体动力半径或Rh。结合DLS和SLS可以估计颗粒浓度,即使是具有多个大小种群的异质样品。

一种流行的DLS仪器是DynaPro板阅读器,通常用于筛选代表不同配方条件或工艺分数的数十到数百个样品。对于更简单的任务,DynaPro NanoStar在微皿中测量粒径和浓度,只需2µL的溶液。

电泳光散射(ELS)是第三种光散射技术,也称为相分析光散射(PALS)。它测量由带电样品在电场中运动引起的入射激光束的频率变化,由此可以计算出电荷或ζ电位。

粒径排除色谱法(SEC)与场流分馏法有何不同国家(FFF) ?

MALS和DLS检测器通常与粒径排除色谱(SEC)或场流分馏(FFF)一起使用,也称为不对称流场流分馏(AF4)。SEC和FFF都可以根据样品的水动力体积进行分离,而下游检测器的添加则可以深入表征样品的生物物理性质。

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SEC使用由多孔珠或树脂组成的固定相,具有特定的孔径。较小的分子扩散进出孔隙,导致停留时间较长,而较大的分子进入较少的孔隙,因此比较小的分子更早被洗脱。

FFF在一个开放的通道中分离分子或粒子,没有固定相。在洗脱模式中,有两种流动:水平通道流和垂直交叉流。较小的颗粒比较大的颗粒更有效地在横流中扩散,并远离通道底部。由于抛物线通道的流动剖面,相对于大颗粒,小颗粒被更高的流速携带,因此FFF中的洗脱顺序与SEC相反,小颗粒先洗脱。

由于FFF通道内没有固定相,对于尺寸大于30纳米的样品、粘附在柱上的样品和/或对剪切敏感的样品,FFF分离通常比SEC更合适。

SEC-MALS用于AAV分析的主要优点是什么?与其他分析方法相比如何?您建议如何建立一个系统并开发适合AAV分析的SEC-MALS方法?

SEC分离可以分离聚合和片段,但不能分离空aav和满aav。空病毒和满病毒将在同一峰洗脱,因为它们的aav具有相同的流体动力学半径。然而,利用在线MALS和浓度检测器的数据,可以计算AAV单体峰和其他感兴趣的峰的空浓度和满浓度。

在单个仪器中,SEC-MALS测量AAV衣壳和被封装dna的分子量和浓度(类似于ELISA和ddpcr的组合),AAV的当量仅为10 - 100µL,运行时间短30分钟,无需试剂,节省了时间和材料,同时提高了准确性和精度。

Wyatt Technology提供的ASTRA软件中的病毒载体分析模块计算了几个AAV特异性cqa: AAV基因组总浓度Vg、AAV衣壳浓度Cp和全衣壳比Vg/Cp。ASTRA还计算空AAV浓度,即Cp减去Vg,以及总含量。

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推荐以下探测器用于多属性定量(MAQ)的最佳AAV系统:DAWN MALS仪器,Optilab dRI探测器和多波长UV探测器。重要的是要有准确的,血清型特异性衣壳和DNA紫外线消光系数。Wyatt Technology提供的默认消光系数对所有AAV血清型都相当准确,但更准确的值可以通过使用Optilab和UV检测器的另一种ASTRA方法确定。

消光系数值然后与MALS-UV-dRI或MALS-UV260-UV280系统一起使用,以确定准确的空滴度和满滴度以及Vg/Cp,聚集物种鉴定和聚集数量。除了上面提到的主要cqa(衣壳含量、衣壳滴度、基因组滴度和聚集)外,同样的SEC-MALS运行还可以用于扩展蛋白质和DNA分子量、衣壳完整性、衣壳大小和游离DNA的表征。

聚合内容是一个重要的CQA。值得注意的是,由于SEC可能过滤掉或破坏大的聚合,FFF-MALS可能更适合于AAV聚合分析。

我们的标准操作程序(SOP)指南手册中规定的SEC条件为不同的AAV血清型提供了良好的单体、聚集体和片段分离。Wyatt的AAV SEC-MALS方法已被许多AAV程序采用为平台方法。它用于多种血清型,并处于不同的开发和商业生产阶段。

与蛋白质和aav相比,LNPs的表征存在哪些挑战?

与蛋白质和aav相比,由于LNPs的新颖性和模式特异性表征工具的有限可用性,在这个阶段LNPs的表征相对较差。LNPs的复杂性源于其庞大的规模和异质性。虽然蛋白质或AAV样品通常具有较少数量的不同物种,但LNP样品通常在大小、分子量和有效载荷上呈现连续分布。

LNPs的几个物理属性是表征和量化所必需的,如下所列。使用常规方法,大约需要10种不同的检测方法来覆盖该列表。

DLS通常用于分析LNP的大小和多分散性,以支持配方、工艺开发和优化。然而,与SEC-MALS等其他光散射方法相比,DLS的分辨率较低。即使是少量的大聚集体也会导致平均大小的显著变化。因此,DLS结果有时只是定性的。

RiboGreen荧光法已被广泛用于定量RNA有效载荷和包封效率。然而,这种间接浓度测定会引入显著的实验误差和用户之间的差异。此外,它没有揭示RNA有效载荷或剂量随LNP大小的变化。

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一个关于Michele Chen博士

Michelle Chen博士是Wyatt technology (Waters CorporationTM的投资组合)的分析科学高级总监。她在耶鲁大学化学工程系获得博士学位,在那里她专注于开发用于高速高效分离生物聚合物的新型高效液相色谱方法。

自加入Wyatt Technology以来,他将多角度光散射和动态光散射检测与高效液相色谱和场流分馏法结合起来,用于表征合成和生物聚合物,蛋白质和纳米颗粒。

近年来,她领导怀亚特的应用团队开发了新的方法来表征和量化新兴的生物纳米颗粒,包括病毒载体,脂质纳米颗粒和细胞外囊泡。

一个关于怀亚特科技

怀亚特科技是沃特斯公司的一个部门,开发仪器、软件和技术,用于表征溶液中的大分子和纳米颗粒,基于光散射和相关技术。Wyatt的产品所确定的物理性质包括蛋白质、聚合物和其他大分子的绝对摩尔质量;尺寸和电荷(ζ电位);蛋白质与蛋白质和其他生物分子的相互作用;共轭蛋白和共聚物的组成;大分子构象。

产品及服务

怀亚特的产品线包括仪器和软件:

  • 在线多角度光散射(MALS),用于co连接与尺寸排除色谱定量绝对摩尔质量,尺寸,构象,等接合和聚集
  • 交付部分(cuvette-based)和高通量(微孔板-based)动态光散射(DLS)来确定尺寸(半径)和尺寸分布,蛋白质熔化温度和稳定性指示参数
  • 电泳迁移率(PALS)测定分子电荷/ ζ电位
  • 用于生物分子相互作用无标记分析的成分梯度光散射
  • field-flow fractio用于1- 1000nm范围内的大分子和纳米颗粒的分离结合在线光散射和其他检测技术来量化摩尔质量和尺寸

怀亚特还提供,在有限的基础上,样品分析服务利用其独特的技术。

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